PCR는 DNA 폴리머라제의 촉매 작용 하에서 시스템에 dNTP, Mg2+, 연장 인자 및 증폭 강화 인자를 첨가하는 것을 의미하는 폴리머라제 연쇄 반응으로, 모 DNA를 주형으로 하고 특정 프라이머를 연장 출발점으로 사용하며, 변성, 어닐링, 확장 등의 단계를 통해 모 가닥 주형 DNA에 상보적인 딸 가닥 DNA를 시험관 내에서 복제하는 과정은 시험관 내에서 모든 표적 DNA를 신속하고 특이적으로 증폭시킬 수 있습니다.
1. 핫 스타트 PCR
기존 PCR의 증폭 시작 시점은 PCR 기계를 PCR 기계에 투입한 후 프로그램이 증폭을 시작하는 시점이 아닙니다.시스템 구성이 완료되면 증폭이 시작되는데, 이로 인해 비특이적 증폭이 발생할 수 있는데, hot-start PCR이 이러한 문제를 해결할 수 있습니다.
핫 스타트 PCR이란 무엇입니까?반응 시스템이 준비된 후, 반응의 초기 가열 단계 또는 "hot start" 단계에서 효소 변형제가 고온(보통 90°C 이상)에서 방출되어 DNA 중합효소가 활성화됩니다.정확한 활성화 시간과 온도는 DNA 중합효소와 hot-start 변형자의 특성에 따라 달라집니다.이 방법은 DNA 중합효소의 활성을 억제하기 위해 주로 항체, 친화성 리간드 또는 화학적 변형자와 같은 변형자를 사용합니다.DNA 중합효소의 활성은 상온에서 억제되기 때문에 hot start 기술은 PCR 반응의 특이성을 희생하지 않고도 상온에서 여러 PCR 반응 시스템을 준비할 수 있는 매우 편리함을 제공합니다.
2. RT-PCR
RT-PCR(역전사 PCR)은 mRNA를 cDNA로 역전사하고 이를 증폭용 주형으로 사용하는 실험 기법입니다.실험방법은 먼저 조직이나 세포에서 total RNA를 추출한 후 Oligo(dT)를 프라이머로 사용하고 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성한 후 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 하여 목적 유전자를 얻거나 유전자 발현을 검출하는 방법입니다.
3. 형광 정량 PCR
형광 정량 PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)은 PCR 반응 시스템에 형광기를 추가하고 형광 신호의 축적을 이용하여 전체 PCR 과정을 실시간으로 모니터링하고 최종적으로 표준 곡선을 이용하여 주형을 정량 분석하는 방법을 말합니다.일반적으로 사용되는 qPCR 방법에는 SYBR Green I 및 TaqMan이 포함됩니다.
4. 중첩 PCR
Nested PCR은 2회의 PCR 증폭을 위해 2세트의 PCR 프라이머를 사용하는 것을 말하며, 2차 증폭 산물은 표적 유전자 단편입니다.
첫 번째 프라이머 쌍(외부 프라이머)의 불일치로 인해 비특이적 산물이 증폭되는 경우 두 번째 프라이머 쌍에서 동일한 비특이적 영역이 인식되어 계속 증폭될 가능성은 매우 적으므로 두 번째 프라이머 쌍에 의한 증폭으로 PCR의 특이성이 향상되었습니다.2회 PCR 수행의 한 가지 장점은 제한된 시작 DNA로부터 충분한 산물을 증폭시키는 데 도움이 된다는 것입니다.
5. 터치다운 PCR
터치다운 PCR은 PCR 주기 매개변수를 조정하여 PCR 반응의 특이성을 향상시키는 방법입니다.
터치다운 PCR에서 처음 몇 주기의 어닐링 온도는 프라이머의 최대 어닐링 온도(Tm)보다 몇도 높게 설정됩니다.Annealing 온도가 높을수록 비특이적 증폭이 효과적으로 감소할 수 있지만, 동시에 Annealing 온도가 높을수록 프라이머와 표적 서열의 분리가 악화되어 PCR 수율이 감소합니다.따라서 처음 몇 사이클에서는 시스템 내 표적 유전자의 함량을 높이기 위해 일반적으로 어닐링 온도를 사이클당 1°C씩 낮추도록 설정합니다.어닐링 온도를 최적 온도로 낮추면 남은 사이클 동안 어닐링 온도가 유지됩니다.
6. 직접 PCR
직접 PCR(Direct PCR)은 핵산 분리 및 정제 과정 없이 시료에서 직접 표적 DNA를 증폭시키는 것을 의미합니다.
직접 PCR에는 두 가지 유형이 있습니다.
직접법: 소량의 샘플을 채취하여 PCR 식별을 위해 PCR Master Mix에 직접 추가합니다.
크래킹 방법: 샘플을 샘플링한 후 lysate에 첨가하고, lyse하여 게놈을 방출하고, 용해된 상청액을 소량 채취하여 PCR Master Mix에 첨가하고, PCR 식별을 수행합니다.이 접근 방식은 실험 작업 흐름을 단순화하고 실습 시간을 줄이며 정제 단계 중 DNA 손실을 방지합니다.
7. SOE PCR
Overlap Extension PCR(SOE PCR)에 의한 유전자 스플라이싱(Gene splicing by Overlap Extension PCR)은 상보적인 말단을 가진 프라이머를 사용하여 PCR 산물이 중첩된 사슬을 형성하도록 하여 이후의 증폭반응에서는 중첩된 사슬의 연장을 통해 서로 다른 소스의 증폭된 단편이 중첩되는 기술 그리고 함께 연결되었습니다.이 기술은 현재 두 가지 주요 응용 방향을 가지고 있습니다: 융합 유전자의 구축;유전자 부위 지정 돌연변이.
8. IPCR
역방향 PCR(IPCR)은 역상보성 프라이머를 사용하여 두 프라이머 이외의 DNA 단편을 증폭하고, 알려진 DNA 단편의 양쪽에 있는 알려지지 않은 서열을 증폭합니다.
IPCR은 원래 인접한 미지 영역의 서열을 결정하기 위해 설계되었으며 주로 유전자 프로모터 서열을 연구하는 데 사용됩니다.유전자 융합, 전좌 및 전위와 같은 발암성 염색체 재배열;및 바이러스 유전자 통합도 현재 일반적으로 사용됩니다. 부위 지정 돌연변이 유발의 경우 원하는 돌연변이가 있는 플라스미드를 복사합니다.
9. dPCR
디지털 PCR(dPCR)은 핵산 분자의 절대 정량화를 위한 기술입니다.
현재 핵산 분자를 정량화하는 방법에는 세 가지가 있습니다.측광법은 핵산 분자의 흡광도를 기반으로 합니다.실시간 형광 정량 PCR(Real Time PCR)은 Ct 값을 기준으로 하며, Ct 값은 검출할 수 있는 형광 값에 해당하는 사이클 수를 의미합니다.디지털 PCR은 단일 분자 PCR을 기반으로 하는 최신 정량 기술로 핵산 계수를 위한 방법 정량은 절대적인 정량 방법입니다.
게시 시간: 2023년 6월 13일