한외여과 원심분리관의 사용 및 주의사항
1) 적합한 한외여과관을 선택합니다.UF 멤브레인은 다양한 화학물질에 대한 내성 수준이 다릅니다.일반적으로, 10 kDa 분자량 컷오프를 갖는 한외여과 튜브는 관심 단백질 분자량의 1/3(예: 35 kDa)을 초과해서는 안 되는 분자량 컷오프를 사용하여 선택할 수 있습니다.관심 있는 단백질의 분자량이 약 10kd인 경우, 분자량 컷오프가 3KD인 한외여과 튜브를 사용할 수 있습니다.
(2) 새로 구입한 한외여과는 사용하기 전에 초순수를 첨가하고 막을 통과한 물을 완전히 통과시킨 후 얼음조 또는 냉장고에 몇 분간 예냉시켜 건조시킨 것이다.그런 다음 물, 즉 단백질 액체를 붓고 첨가한 양 중 튜브 상단의 흰색 선을 넘지 않는 양을 따릅니다.작업은 간단하며 단백질 용액을 추가하기 전에 한외여과 튜브를 얼음 위에서 미리 냉각해야 합니다.
3) 질량과 무게중심이 모두 균형을 이룬다.회전 속도와 가속도는 그리 빠르지 않습니다. 그렇지 않으면 한외여과막이 직접적으로 손상됩니다.원심분리 한외여과가 시작되었습니다(원심분리기는 4도로 예냉됨).서로 다른 원심분리기의 RPM을 g로 변환한 후에는 달라졌습니다.원심분리기의 가속도를 최소로 조정하여 멤브레인에 가해지는 압력을 줄였습니다.주의할 점은 원심분리기가 목적지 속도에 도달한 후 반드시 원심분리기를 떠나야 하며, 그렇지 않으면 문제가 발생하면 처음으로 처리할 수 없게 됩니다.스핀들에 대한 멤브레인의 배향은 지침에 따라 조정되었습니다(각진 원심분리기의 경우 멤브레인과 축이 수직임).실제 사용 시 일반 회전 속도는 설명서에 표시된 회전 속도보다 낮으므로 원심분리 튜브의 수명을 연장할 수 있습니다.
3) 질량과 무게중심이 모두 균형을 이룬다.회전 속도와 가속도는 그리 빠르지 않습니다. 그렇지 않으면 한외여과막이 직접적으로 손상됩니다.원심분리 한외여과가 시작되었습니다(원심분리기는 4도로 예냉됨).서로 다른 원심분리기의 RPM을 g로 변환한 후에는 달라졌습니다.원심분리기의 가속도를 최소로 조정하여 멤브레인에 가해지는 압력을 줄였습니다.주의할 점은 원심분리기가 목적지 속도에 도달한 후 반드시 원심분리기를 떠나야 하며, 그렇지 않으면 문제가 발생하면 처음으로 처리할 수 없게 됩니다.스핀들에 대한 멤브레인의 배향은 지침에 따라 조정되었습니다(각진 원심분리기의 경우 멤브레인과 축이 수직임).실제 사용 시 일반 회전 속도는 설명서에 표시된 회전 속도보다 낮으므로 원심분리 튜브의 수명을 연장할 수 있습니다.
(4) 남은 1ml가 농축되면 완충용액 50ul를 취하고 flow through 10ul를 첨가하여 푸른색이 나타나는지 확인하여 한외여과관에 단백질이 빠져있는지 판단한다.튜브가 새는 경우 상위 층을 다시 붓고 새 튜브에 관류하여 한외여과를 시작합니다.튜브가 누락되었는지 정확하게 확인하려면 흐름 통과 전 BSA 5mgml로 10분 동안 원심분리하고, 단백질 접착제 또는 브래드포드 원유 분석법을 사용하고, 남은 농축 단백질 용액(얼음 위에서 작동하고 단백질이 가열되는 것을 방지함)을 계속 추가합니다. 모든 농축액이 추가되었습니다.원심분리 중에 단백질 침전이 발생하여 튜브가 폐쇄될 경우 주의하십시오.침전이 발생하면 침전의 구체적인 원인이 과도한 단백질 농도인지 부적절한 완충액인지 확인합니다.전자는 여러 개의 한외여과관을 동시에 한외여과하여 농도를 감소시킴으로써 해결될 수 있고, 후자는 단백질 침전이 일어나지 않을 때까지 서로 다른 완충액을 교환함으로써 해결될 수 있습니다.
(4) 남은 1ml가 농축되면 완충용액 50ul를 취하고 flow through 10ul를 첨가하여 푸른색이 나타나는지 확인하여 한외여과관에 단백질이 빠져있는지 판단한다.튜브가 새는 경우 상위 층을 다시 붓고 새 튜브에 관류하여 한외여과를 시작합니다.튜브가 누락되었는지 정확하게 확인하려면 흐름 통과 전 BSA 5mgml로 10분 동안 원심분리하거나 단백질 접착제 또는 브래드포드 원유 분석을 실행하고 남은 농축 단백질 용액(얼음 위에서 작동하고 단백질이 가열되는 것을 방지함)을 추가하여 계속합니다. 모든 농축액이 추가되었습니다.원심분리 중에 단백질 침전이 발생하여 튜브가 폐쇄될 경우 주의하십시오.침전이 발생하면 침전의 구체적인 원인이 과도한 단백질 농도인지 부적절한 완충액인지 확인합니다.전자는 여러 개의 한외여과관을 동시에 한외여과하여 농도를 감소시킴으로써 해결될 수 있고, 후자는 단백질 침전이 일어나지 않을 때까지 서로 다른 완충액을 교환함으로써 해결될 수 있습니다.
(5) 처음 몇 단계는 단백질을 농축하는데 사용되며, 완충액을 교체할 경우 총 단백질 약 1ml에 새로운 완충액(0.22um 한외여과막을 통한 한외여과)을 천천히 첨가하고 3회에 걸쳐 약 1ml로 재농축합니다. 원하는 단백질 농도에 따라 최종 농축 최종 부피가 연속적으로 반복되며, 일반적으로 500ul 이하이지만 200ul 이내입니다.세 번에 걸쳐 1000배 이상을 달성합니다. 이는 기본적으로 매회 최소 10배 정도의 볼륨 강화로 계산된 버퍼 변경만큼입니다.
(5) 처음 몇 단계는 단백질을 농축하는데 사용되며, 완충액을 교체할 경우 총 단백질 약 1ml에 새로운 완충액(0.22um 한외여과막을 통한 한외여과)을 천천히 첨가하고 3회에 걸쳐 약 1ml로 재농축합니다. 원하는 단백질 농도에 따라 최종 농축 최종 부피가 연속적으로 반복되며, 일반적으로 500ul 이하이지만 200ul 이내입니다.세 번에 걸쳐 1000배 이상을 달성합니다. 이는 기본적으로 매회 최소 10배 정도의 볼륨 강화로 계산된 버퍼 변경만큼입니다.
게시 시간: 2022년 11월 9일